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El microscopio confocal se refiere a una especie de microscopio óptico especial que puede registrar rodajas ópticas.
Al iluminar y observar un solo punto de límite de difracción, el corte óptico se realiza en un sistema confocal láser. Esto requiere que los dos segmentos de haz tengan el mismo enfoque, por lo que son "confocales". Contrariamente a las imágenes de campo amplio, las imágenes confocales no tienen desenfoque de desenfoque. Esta es una ventaja en sí misma, porque la imagen profunda de la muestra es clara y rica en detalles. Sin embargo, la ventaja más importante es su potencial de visualización tridimensional con características microscópicas. Después de adquirir la secuencia de la imagen a lo largo de la pila Z, la computadora reconstruye y muestra el objeto 3D.
- Iluminación confocal
La iluminación de la fuente de luz puntual se realiza enfocando la fuente de luz en una pequeña apertura (agujecida) y luego enfocándola en la muestra. Cuando la abertura es lo suficientemente pequeña, el punto de iluminación solo está limitado por la difracción, no por los parámetros geométricos de la fuente de luz y la abertura. La fuente de luz ordinaria es una fuente de luz de superficie grande, por lo que es imposible enfocarla en el punto de límite de difracción. Por lo tanto, aunque la transmitancia es muy baja, este tipo de luz de iluminación enfocada sigue siendo muy necesaria (para las fuentes de luz tradicionales).
Figura 1: Iluminación para imágenes confocales. La luz de la fuente de luz (LS) se centra en el agujero de la iluminación (PI) y luego ingresa a la muestra S ..
El láser como fuente de luz tiene una colimación muy alta (la luz en un buen láser es "extremadamente paralelo"). Por lo tanto, el láser se puede centrar en un punto limitado por difracción a través de una sola lente sin usar un agujero de alfiler. Por lo tanto, la mayoría de los microscopios confocales no tienen un agujero de infarto de iluminación. La calidad del punto de luz depende de la calidad del haz del láser. Si la calidad no es buena, también puede insertar el agujero de iluminación. El láser generalmente se acopla al microscopio confocal a través de la fibra óptica. Estas fibras mismas también actúan como agujeros.
La focalización y la alta densidad de energía del láser lo convierten en una fuente de luz ideal para el microscopio confocal. La coherencia del láser no es una característica requerida del rendimiento confocal. Por el contrario, es un desafío para los diseñadores ópticos, porque causará patrones de interferencia falsos, por lo que se necesitan estrategias de diseño cuidadosas.
Además, el hecho de que el láser tradicional solo emite un solo color (láser- "línea") tiene sus propias limitaciones. En imágenes y medición multifluorescencia, se necesita una disposición compleja de múltiples láser. El láser blanco resuelve hábilmente el problema de la imagen multicolor.
Figura 2: Comparación de imágenes confocales (área derecha) y no confocal. En el trofoblasto de ratón manchado de Feulgen. Mucha información de imágenes no confocales no proviene del plano focal. La óptica confocal elimina todos los factores difusos y deja la estructura en claro.
Detección confocal
La mayoría de los detectores tienen un área sensible bastante grande (los tubos fotomultiplicadores suelen ser varios centímetros cuadrados). La óptica confocal necesita detección de puntos. Por lo tanto, es necesario realizar la detección de manchas insertando una pequeña apertura (agujecida) en el haz de luz. Enfocando la luz de la muestra en el agujero de alfiler, recolectando y registrando la luz transmitida.
Debido a que el patrón de difracción depende de la abertura numérica y la longitud de onda, es necesaria la detección de agujeros para agujeros. Por lo tanto, cuando estos parámetros cambian, el tamaño del agujero de alfiler debe ajustarse.
Cuando la lente objetivo cambia (generalmente con el cambio de la apertura numérica), el microscopio de escaneo confocal moderno cambiará automáticamente el diámetro de agujero de alfiler de manera apropiada. Por lo tanto, los agujeros de los pinos generalmente se diseñan como aperturas de doble o múltiples capas.
De hecho, el tamaño apropiado del agujero de alfiler depende no solo de la longitud de onda y la abertura numérica, sino también de la ampliación interna de los elementos ópticos en el microscopio.
Por lo tanto, no solo es indeseable, sino que también es incorrecto comparar directamente los diámetros de agujero de alfiler en microscopios con diferentes diseños. Si el diámetro del agujero de alfiler no está configurado en el valor óptimo, el sistema no podrá realizar un corte óptico sin problemas (es decir, transmitir desenfoque desenfocus) o cortar la intensidad innecesariamente sin obtener una calidad de corte óptica adicional (lo que resulta en imágenes de ruido innecesarias).
Figura 3: Detección en imágenes confocales. La luz de la muestra S se centra en el agujero de observación (PO) y luego en el detector DE.
Ruta óptica de escaneo confocal
La ruta del haz confocal en el sistema de escaneo confocal es solo la combinación de iluminación de la fuente puntual y detección de puntos. Esta combinación se puede usar como un cuchillo óptico. Solo los fotones del plano focal se pueden transmitir al sensor. Mientras que todos los fotones de otros lugares se filtran. El corte óptico se realiza mediante "filtro espacial".
Debido a que solo aparece un punto de imagen "confocal" en un momento dado, se necesita un dispositivo de escaneo para mover el punto en el campo del objeto en modo de cuadrícula. Por lo general, el espejo óptico se instala en el motor de escaneo y se utiliza para ejecutar el procedimiento de escaneo. Hay un cuello de botella en el tiempo requerido para escanear un cuadro completo (generalmente) 1.024 líneas. Se han logrado mejoras introduciendo un escáner de alta velocidad (escáner de resonancia) que escanea 8, 000 o más líneas por segundo.
Solo bajo la tecnología de microscopio de luz reflejada se puede lograr una buena porción óptica. Esta es una de las razones del desarrollo vigoroso de la microscopía de fluorescencia en los últimos 20 años (otras razones incluyen la invención de inmunotinción, hibridación de ADN, biosensor fluorescente, puntos cuánticos y proteína fluorescente).
Figura 4: De izquierda a derecha: 1. El cono de iluminación no solo excita el tinte fluorescente en el plano focal, sino que también lo excita hacia arriba y hacia abajo. Aquí representado por un doble cono verde. 2. El agujero de emisión intercepta efectivamente la luz emitida desde arriba del plano focal. 3. Además, la luz desde debajo del plano focal no pasará a través del agujero de alfiler. 4. En el sistema confocal, solo la luz de la muestra llegará al detector. La detección de agujeros rechazará efectivamente cualquier luz de otras áreas. Finalmente, se obtiene la sección óptica real.
